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非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。臨床上以豬高熱、食欲廢絕、皮膚發(fā)紺、內(nèi)臟實質(zhì)、器官出血、呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂為主要特征。被動物衛(wèi)生組織(OIE)列為必須報告的動物疫病,在我倍列為一類動物疫病。該病病程短,死亡率*,已對發(fā)病家的養(yǎng)豬業(yè)造成災(zāi)難性打擊。
2018年7月,遼寧省沈陽市發(fā)生*非洲豬瘟疫情,截止2019年上半年,全共發(fā)生非洲豬瘟疫情100余起,包括25個省份(安徽、貴州、河南、黑龍江、湖北、湖南、吉林、江蘇、遼寧、內(nèi)蒙古、山西、陜西、天津、云南、浙江、重慶、江西、福建、四川、上海、北京、青海、廣東、甘肅、寧夏),非洲豬瘟對我養(yǎng)豬業(yè)的危害日益嚴(yán)峻。
ASFV是非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬的WEI一成員,病毒基因組全長170~ 190 kb ,為有囊膜的雙股線狀DNA病毒,病毒粒子大小為175~215 nm,呈正二十面體結(jié)構(gòu)。該病毒可使各種日齡和品種的家豬與野豬感染并發(fā)病,病毒可在多數(shù)蜱種中增殖,使蜱成為病毒的貯藏宿主和主要傳播媒介。該病毒早于1921年在非洲東部肯尼亞被發(fā)現(xiàn),隨后開始在撒哈拉以南的非洲東部、中部、南部等地區(qū)蔓延。1957 年病毒從非洲的安哥拉傳到歐洲的西班牙,病毒開始在歐洲呈零星、持續(xù)流行。1971 年病毒從西班牙傳入南美洲的古巴,南美洲和拉丁美洲的多數(shù)家陸續(xù)暴發(fā)疫情。2007年病毒傳入歐亞接壤的高加索地區(qū),隨后開始向俄羅斯南部地區(qū)擴散流行,2017年傳播至俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)伊爾庫茨克,導(dǎo)致傳入我的風(fēng)險升高。2018年7月末,遼寧省沈陽市一養(yǎng)豬戶飼養(yǎng)的豬陸續(xù)發(fā)生不明原因死亡,病死豬剖檢發(fā)現(xiàn)脾臟異常腫大,疑似非洲豬瘟病毒感染,經(jīng)家外來動物疫病研究中心檢測,確診為非洲豬瘟病毒核酸陽性,通過序列分析發(fā)現(xiàn)引起該疫情的非洲豬瘟病毒B646L/p72基因序列與俄羅斯毒株100%匹配,與俄羅斯和東歐目前流行的格魯吉亞毒株( Georgia 2007 )屬于同-進(jìn)化分支,這是我發(fā)現(xiàn)的*非洲豬瘟,目前階段,面對非洲豬瘟還是以防疫銷毀為主。那么問題來了,當(dāng)豬類養(yǎng)殖戶或者豬肉產(chǎn)品加工企業(yè)應(yīng)該如何檢測非洲豬瘟?依據(jù)哪些家標(biāo)準(zhǔn)來進(jìn)行檢測呢?
有關(guān)非洲豬瘟的檢測標(biāo)準(zhǔn)主要有:
GB/T 18648-2002 《非洲豬瘟診斷技術(shù)》 、
SN/T 1559-2010 《非洲豬瘟檢疫技術(shù)規(guī)范》、
SZDB/Z131-2015《非洲豬瘟病毒抗體檢測阻斷酶聯(lián)免疫吸附法》 、
T/CVMA 5-2018 《非洲豬瘟病毒實時熒光 PCR 檢測方法》 等。
這其中 GB/T 18648-2002 《非洲豬瘟診斷技術(shù)》制定時,我還尚未發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟,所以只介紹了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試驗(PCR)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)兩種試驗方法。更多具體檢測試驗方法可以依據(jù)SN/T 1559-2010 《非洲豬瘟檢疫技術(shù)規(guī)范》來進(jìn)行。其次,有關(guān)非洲豬瘟病毒鑒定檢測的試驗主要病毒紅細(xì)胞吸附試驗(HAD)、病毒熒光抗體試驗(FAT)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試驗(PCR)、基因組Taqman探針熒光PCR試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、間接熒光抗體試驗(IFAT)、免疫印跡試驗等。
下面對主要的幾種檢測方法做一個簡單的介紹
1. 膠體金試紙檢測方法
膠體金試紙檢測方法是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物,利用層忻技術(shù)實現(xiàn)抗原抗體特異性檢測的一種新型的免疫檢測技術(shù)。該方法具有快速、靈敏、特異等優(yōu)點,該方法操作簡單,無需儀器設(shè)備,直接采血滴加到試紙條上20分鐘即可查看結(jié)果,尤其適合臨床的快速診斷,但該方法的敏感性較高,易出現(xiàn)假陽性。
2.PCR法
PCR方法操作簡單、檢測快速,是目前簡單的分子生物學(xué)檢測技木,但該方法的敏感性有限,且擴增后電泳檢測需要使用溴化乙錠,具有一定的毒性。PCR檢測方法具有很好的實用性,檢測結(jié)果準(zhǔn)確率較高,可以有效地應(yīng)用于ASF的診斷以及防控。
3. 熒光定量PCR方法
實時熒光定量PCR方法是將光譜技術(shù)引入到PCR反應(yīng)中,通過熒光信號的強弱變化定量測定特異性擴增產(chǎn)物的量,解決了常規(guī)PCR方法敏感性低和電泳檢測中溴化乙錠對環(huán)境的污染問題。熒光定量PCR方法敏感性高、特異性強,已逐步成為ASFV的臨床診斷、檢疫、食品安全檢驗的重要方法。
4. ELISA方法
ELISA方法高通量、檢測快速、操作簡單,是目前常用的免疫學(xué)診斷技術(shù),可用于豬群中ASFV感染的大規(guī)模調(diào)查。該方法具有敏感性高、重復(fù)性好、特異性強、準(zhǔn)確性高等特點。但作為血清學(xué)檢測技術(shù)該方法具有一定的滯后性,無法對ASFV的早期感染做出診斷。
在我的《家中長期動物疫病防治規(guī)劃( 2012-2020)》中,ASF被列為優(yōu)先防范的13種重大外來動物疫病之一,且我已發(fā)生* ASF疫情,該病但在我廣泛流行,將給我養(yǎng)豬業(yè)及養(yǎng)豬相關(guān)產(chǎn)業(yè)造成巨大沖擊。目前應(yīng)加強流行病學(xué)調(diào)直和主動監(jiān)測排查工作,保持高度警惕,防止該病在我的進(jìn)一步流行。
本文簡單介紹了ASF各種診斷技術(shù)方法的優(yōu)缺點,綜合比較來看,目前熒光定量PCR法是效果較好,污染較小的檢測方法,廣泛適用于養(yǎng)殖場、屠宰場、畜牧、疾控、食品企業(yè)、檢測機構(gòu)等領(lǐng)域,是非洲豬瘟防控的優(yōu)選檢測方法。
熒光定量PCR非洲豬瘟檢測 配置方案
序號 | 名稱 | 規(guī)格型號 | 單位 | 數(shù)量 | 備注 |
1 | 便攜式實時熒光定量PCR儀 | 16孔 雙通道 | 臺 | 1 | 核心部件全進(jìn)口 |
選配配件
序號 | 名稱 | 規(guī)格型號 | 單位 | 數(shù)量 | 備注 |
1 | 迷你離心機 |
| 臺 | 1 | 實驗所需儀器 |
2 | 移液器 | 10μL | 支 | 1 | 實驗所需儀器 |
3 | 移液器 | 200μL | 支 | 1 | 實驗所需儀器 |
4 | 旋渦震蕩儀 |
| 臺 | 1 | 實驗所需儀器 |
5 | U盤 | 16G | 個 | 1 | 數(shù)據(jù)儲存 |
6 | 非洲豬瘟熒光檢測PCR試劑盒 |
| 盒 | 1 |
|
7 | PCR八連管 |
| 條 | 30 | 實驗所需耗材 |
8 | 10μL吸頭 | 96支/盒 | 盒 | 1 | 實驗所需耗材 |
9 | 200μL吸頭 | 96支/盒 | 盒 | 1 | 實驗所需耗材 |
10 | 1.5mL離心管 |
| 個 | 200 | 實驗所需耗材 |
11 | 乳膠手套 |
| 雙 | 30 | 個人防護(hù) |
12 | 1.5mL離心管架 | 60孔 | 個 | 1 | 實驗所需耗材 |
13 | PCR管架 | 96孔 | 個 | 1 | 實驗所需耗材 |
14 | 醫(yī)用口罩 |
| 只 | 10 | 個人防護(hù) |
15 | 記號筆 | 黑色 | 支 | 1 | 樣本標(biāo)記編號 |
16 | 計時器 |
| 個 | 1 | 實驗計時 |
17 | 冰盒 | 藍(lán)色 | 個 | 1 | 樣品保存用 |
18 | 實驗用剪刀 |
| 把 | 1 | 實驗用 |